Le séquençage de l’ADN : une révolution technologique et médicale

Depuis la description de la structure de l’ADN, la biologie a connu une suite de remarquables progrès technologiques dont le séquençage constitue l’un des évènements clés. De nos jours, de nouvelles technologies existent dans le domaine du séquençage. Cette technique utilise les connaissances qui ont été acquises depuis plusieurs années  sur les mécanismes de la réplication de l’ADN. Voici tout ce qu’il faut savoir sur les différentes méthodes de séquençage.

Le séquençage de l’ADN

Qu’est-ce que l’ADN ?

L’acide désoxyribonucléique est présent dans chaque cellule vivante et la molécule a la forme d’une double hélice. L’ensemble de l’ADN dans une cellule rassemble toute l’information permettant à l’organisme qui la contient de se développer et de se gérer.

 

Qu’est-ce le séquençage de l’ADN ?

Le séquençage de l’ADN génomique est la lecture de la succession des lettres qui constituent le génome. Il consiste à déterminer l’ordre d’enchaînement des nucléotides pour un fragment d’ADN donné. Les techniques de séquençage utilisent des enzymes particulières tels que les ADN polymérases. Ces enzymes sont capables de synthétiser un brin complémentaire d’ADN à partir d’un brin matrice. Le séquençage de l’ADN est une méthode pour déterminer la succession linéaire des bases A, C, G et T prenant part à la structure de l’ADN. La lecture des séquences d’ADN permet d’étudier l’information biologique contenue par celle-ci.

 

Méthode de séquençage de l’ADN

Avant de passer par le séquençage du génome, il faut d’abord connaître la structure d’un génome. Il est aussi nécessaire de coupler les approches de biologie moléculaire et d’informatique pour pouvoir gérer des millions de données. Il existe deux méthodes de séquençage de génome : la méthode de séquençage de l adn par ordonnancement hiérarchique et la méthode globale.

• Ordonnancement hiérarchique : elle se fait par extraction, ensuite l’ADN est découpé par sonication en fragments puis il sera cloné dans un vecteur ou BAC. Cette méthode consiste à classer les fragments génomiques obtenus avant de séquencer l’ADN. Le nombre de clones permet une représentation de 5 à 10 fois le génome total. Ensuite, le chevauchement et l’ordonnancement des clones sont réalisés par hybridation de sondes spécifiques, par analyse des profils de restriction ou par ordonnancement après séquençage et hybridation des extrémités des Bacs. Après l’ordonnancement, les clones sont fragmentés, séquencés et assemblés par informatique.
• Méthode globale : c’est une méthode de séquençage au tout venant  d’ADN fragmenté qui est mise au point par le groupe Celera Genomics sur des génomes bactériens, le génome de la drosophile et sur les génomes de l’homme et de la souris. En premier lieu, il faut réaliser plusieurs fragments d’ADN aléatoires de tailles différentes et les clones sont séquencés puis assemblés. Enfin, la séquence totale est réalisée à force de recouvrements et d’assemblages.

Les techniques de séquençage de l’ADN

La méthode Sanger

La technologie Sanger a été décrite dans les articles Le séquençage d’un ADN et Le séquençage des génomes. Le séquençage Sanger d’un fragment d’ADN nécessite d’abord de le cloner dans un plasmide, on introduit ensuite dans une cellule hôte la bactérie ou la levure. Cette cellule hôte se multiplie et donne un grand nombre de copies de chaque fragment d’ADN d’origine. Après purification, cet ADN peut être séquencé en utilisant une ADN polymérase qui synthétise un brin complémentaire à partir d’un brin matrice du fragment d’ADN d’intérêt et la synthèse s’arrête quand la polymérase incorpore un des quatre didésoxynucléotides. Cela génère un mélange de molécules qui se terminent à chaque position où se trouve un A, un C, un G, ou un T (selon le type de didésoxynucléotide présent). Les fragments dans ce mélange sont ensuite séparés selon leur taille par électrophorèse sur gel. La connaissance du didésoxynucléotide qui a été incorporé dans chaque réaction permet ainsi de déduire la séquence du fragment d’ADN d’intérêt.

 

La technique de Shotgun

C’est un séquençage aléatoire global utilisé pour le séquençage d’un grand nombre de génomes bactériens (plus longue que la moyenne) .Il y a deux méthodes pour ce type de séquençage de génomes :

• Le shotgun génome complet : qui s’applique aux génomes relatives simples et il exploite le plus d’informations de cartographie et de bioinformatique pour éviter les mises à assemblages.
• Le shotgun hiérarchique ou clone par clone : il se fait par jeu de clones de grande taille pour couvrir le génome et puis de soumettre des clones bien choisis. Son but est d’éliminer les risques d’erreur.